Топологически связанные доменные границы необходимы для нормального функционирования генома.

Биология связи, том 6, Номер статьи: 435 (2023) Цитировать эту статью

5721 Доступов

48 Альтметрика

Подробности о метриках

Границы топологически ассоциированных доменов (TAD) разделяют геном на отдельные регуляторные территории. Неофициальные данные свидетельствуют о том, что их нарушение может мешать нормальной экспрессии генов и вызывать фенотипы заболеваний1,2,3, но общая степень, в которой это происходит, остается неизвестной. Здесь мы демонстрируем, что целенаправленное удаление границ TAD вызывает ряд нарушений нормальной функции генома in vivo и развития организма. Мы использовали редактирование генома CRISPR на мышах, чтобы индивидуально удалить из генома восемь границ TAD (размером 11–80 КБ). Все исследованные делеции приводили к обнаружению молекулярных или организменных фенотипов, которые включали изменение взаимодействия хроматина или экспрессии генов, снижение жизнеспособности и анатомические фенотипы. Мы наблюдали изменения в локальной трехмерной архитектуре хроматина в 7 из 8 (88%) случаев, включая слияние TAD и изменение частоты контактов внутри TAD, прилегающих к удаленной границе. Для 5 из 8 (63%) исследованных локусов граничные делеции были связаны с повышенной эмбриональной летальностью или другими фенотипами развития. Например, делеция границы TAD вблизи Smad3/Smad6 вызывала полную эмбриональную гибель, тогда как делеция вблизи Tbx5/Lhx5 приводила к тяжелым порокам развития легких. Наши результаты демонстрируют важность граничных последовательностей TAD для функционирования генома in vivo и усиливают острую необходимость тщательного рассмотрения потенциальной патогенности некодирующих делеций, влияющих на границы TAD, при клиническом генетическом скрининге.

Геномы эукариот складываются в топологически ассоциированные домены (TAD), сегменты хроматина субмегабазного масштаба, характеризующиеся высокой частотой внутридоменных контактов хроматина4,5,6. TADs представляют собой ключевую особенность иерархической организации генома, определяя окрестности хроматина, внутри которых могут взаимодействовать регуляторные последовательности, одновременно изолируя регуляторные взаимодействия через границы5,7,8,9,10. Границы TAD в первую очередь определяются и измеряются с помощью анализов конформации хроматина, и они обычно связаны с набором сигнатур белков, включая фактор связывания CCCTC (CTCF), компоненты комплекса структурного поддержания хромосом (SMC), такие как когезин и конденсин, и РНК-полимераза II5,11,12,13,14. TAD образуются в результате экструзии петли, при которой нити ДНК скользят из комплекса когезина или SMC до тех пор, пока не встретятся связанные молекулы CTCF в конвергентной ориентации13,15,16,17,18,19. Потеря CTCF, когезина или фактора загрузки когезина Nipbl приводит к разрушению TAD, тогда как потеря фактора высвобождения когезина, Wapl, приводит к усилению границ TAD20,21. Интересно, что ~20% границ TAD остаются стабильными после потери CTCF22. Как CTCF-опосредованные механизмы, так и транскрипция могут влиять на образование и функцию TADs, но они не кажутся ни достаточными индивидуально, ни универсальными7,11,23,24. Т.о., состояние хроматина, транскрипционная активность и организация TAD могут влиять друг на друга, а наблюдаемая ядерная структура геномов млекопитающих, вероятно, является результатом их сложного взаимодействия7,11,23,24,25.

Геномное расположение границ TAD хорошо консервативно у разных видов млекопитающих, что указывает на то, что их функции и положения в геноме подвержены эволюционным ограничениям5,26,27,28. Это мнение дополнительно подтверждается общим истощением структурных вариантов на границах TAD, наблюдаемым в общей популяции людей26, в то время как нарушения и перестройки структуры TAD связаны с неправильной экспрессией генов и связаны с фенотипами развития и рака1,2, 3,29,30. Однако большинство этих нарушений были спонтанно возникающими крупными структурными мутациями, которые также включали соседние геномные особенности, такие как регуляторные элементы и/или гены, кодирующие белки. Следовательно, специфическая роль границ TAD в этих фенотипах не совсем понятна. В настоящем исследовании мы изучаем функциональную необходимость граничных последовательностей TAD in vivo. Мы выбрали восемь независимых границ TAD вблизи генов, активных во время эмбрионального развития, индивидуально удалили эти границы из генома мыши и систематически исследовали влияние на выживаемость, организацию генома, экспрессию генов и развитие. Все восемь удалений границ TAD вызвали изменения одного или нескольких из этих свойств. Мы также заметили, что потеря границ с большим количеством сайтов CTCF обычно приводила к более тяжелым фенотипам и что наиболее тяжелые фенотипы организма совпадали с выраженными изменениями конформации хроматина. В совокупности наши результаты показывают, что граничные последовательности TAD необходимы для нормального функционирования и развития генома.

3300 previously annotated TAD boundaries5,10, we scored and prioritized each boundary based on the following criteria: (1) CTCF occupancy aggregated from 62 published CTCF ChIP-seq datasets, which served as a proxy for the expected overall strength of insulation (datasets listed in Supplementary Data 1); (2) co-occupancy of subunits of the cohesin complex and the transcription factor Znf14331 from 38 published ChIP-seq datasets (Supplementary Data 1); (3) CTCF-binding conservation at orthologous regions in four different mammalian species32 (Supplementary Data 2); and (4) whether both flanking TADs contain genes with known roles in embryonic development, preferentially showing divergent patterns of tissue-specific expression (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 1–3, “Methods”). TAD boundaries that encompassed protein-coding genes were excluded. Following genome-wide prioritization, we selected and deleted 8 individual TAD boundaries from the mouse genome through pronuclear injection of fertilized eggs using CRISPR/Cas9. For all deletions, the outer borders of the boundaries were defined by canonical criteria including the presence of CTCFs and cohesin complex proteins, which are the hallmark of TAD boundaries that are conserved across cell types in closely related species (refs. 13,15,16,17,18,19; see “Methods” for details). These deletions ranged in size from 11 to 80 kb and removed all known CTCF and cohesin binding sites in each TAD boundary region, while leaving any nearby protein-coding genes intact (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 3, “Methods”). For all eight boundaries, live founder mice heterozygous for the targeted deletion were successfully obtained and bred into stable lines to assess molecular and organismal phenotypes./p>

6000 data points across 350 total measurements; Fig. 4a, Supplementary Fig. 10 and Supplementary Data 7). These systematic phenotyping efforts identified 30 additional parameters with individually significant deviations from wild-type controls (Supplementary Data 7). However, due to the limited sample size and the large number of parameters assessed, these initial observations are generally not significant after correction for multiple hypothesis testing. Nevertheless, in conjunction with the independently observed viability, chromatin, and expression phenotypes in these lines, these data provide leads for further in-depth characterization./p>

0.05; Fig. 3 and Supplementary Fig. 4. Interaction frequencies between genomic loci were additionally visualized on Juicebox (Supplementary Fig. 4)53,54./p>