Весь | Группа изоляторов Цзясин

Nature, том 615, страницы 925–933 (2023 г.) Процитировать эту статью

26 тысяч доступов

2 цитаты

275 Альтметрика

Подробности о метриках

Полногеномное удвоение (WGD) является повторяющимся явлением при раке человека и способствует хромосомной нестабильности и приобретению анеуплоидий1,2,3,4,5,6,7,8. Однако трехмерная организация хроматина в клетках WGD и ее вклад в онкогенные фенотипы в настоящее время неизвестны. Здесь мы показываем, что в клетках с дефицитом p53 WGD индуцирует потерю сегрегации хроматина (LCS). Это событие характеризуется снижением сегрегации между короткими и длинными хромосомами, субкомпартментами A и B и соседними доменами хроматина. LCS обусловлен подавлением CTCF и H3K9me3 в клетках, которые обходят активацию тетраплоидной контрольной точки. Продольный анализ показал, что LCS стимулирует геномные области для репозиционирования субкомпартментов в клетках WGD. Это приводит к хроматину и эпигенетическим изменениям, связанным с активацией онкогенов в опухолях, происходящих из клеток WGD. Примечательно, что события репозиционирования субкомпартментов в значительной степени не зависели от хромосомных изменений, что указывает на то, что это были дополнительные механизмы, способствующие развитию и прогрессированию опухоли. В целом, LCS инициирует изменения конформации хроматина, которые в конечном итоге приводят к онкогенным эпигенетическим и транскрипционным модификациям, что позволяет предположить, что эволюция хроматина является отличительной чертой рака, обусловленного WGD.

WGD определяется дупликацией всего набора хромосом внутри клетки. Это наблюдалось при ранних и предраковых поражениях различных тканей2,9,10 и, по оценкам, встречается примерно в 30% случаев рака у человека3. WGD благоприятствует приобретению хромосомных изменений5,6,7,8 в допустимых генетических фонах, например, в клетках с дефицитом p53 или Rb3,4, которые могут способствовать онкогенезу1,5. Однако тетраплоидизация одиночных ядер с равной вероятностью может вызвать изменения в трехмерной (3D) структуре и эпигенетических особенностях хроматина. Во время интерфазы хроматин организован в многослойную трехмерную архитектуру компартментов, хроматиновых доменов и петель11,12,13,14,15,16 и тесно связан с активностью хроматина и состояниями клеток17. Об изменениях структуры хроматина сообщалось во многих типах опухолей и они происходят из-за изменения связывания CTCF или когезина18,19, структурных вариантов хромосом20,21,22 или аберрантных модификаций гистонов22,23,24,25. Здесь мы исследуем, как организован хроматин в клетках, подвергающихся WGD. Кроме того, мы изучаем, на какие особенности структуры хроматина влияет WGD и возникают ли изменения в организации хроматина и влияют ли они на фенотипы клеток после WGD. Наконец, мы исследуем, коррелируют ли эти изменения с генетическими и эпигенетическими изменениями в опухолях, вызванных WGD.

Чтобы понять влияние WGD на организацию хроматина и развитие опухоли, мы использовали три различные клеточные модели: (1) нетрансформированную диплоидную клеточную линию hTERT-RPE1 (далее называемую RPE); (2) клетки CP-A, полученные от пациента с пищеводом Барретта, предраковым состоянием, которое предрасполагает к развитию аденокарциномы пищевода через WGD9,26; и (3) лейкемическую почти триплоидную клеточную линию K562. Чтобы имитировать пермиссивный генетический фон, наблюдаемый в опухолях человека3,26, мы использовали CP-A с дефицитом p53 (расширенные данные, рис. 1a) и клетки RPE (ранее называемые клетками RPETP53-/-)27. Клетки K562 уже содержат мутацию потери функции в гене TP5328. Клетки WGD были получены посредством митотического проскальзывания в двух независимых клонах CP-A TP53-/- (клон 3 и клон 19) и клетках K562, а также в результате нарушения цитокинеза с использованием двух разных протоколов в клетках RPE TP53-/- (рис. 1a). Чтобы контролировать изменения конформации хроматина, связанные с хромосомной нестабильностью (CIN), но не WGD, мы индуцировали CIN в клетках RPE TP53-/- с помощью ингибитора MPS1 (рис. 1a). Анализ клеточного цикла и кариотипа подтвердил, что количество хромосом удвоилось после лечения в большинстве клеток (рис. 1b, c и расширенные данные, рис. 1b-g) и что размер ядра увеличился (расширенные данные, рис. 1h).

1, adjusted P < 0.01) were enriched in the interferon signalling pathway (Extended Data Fig. 4b), which is consistent with responses to abnormal mitotic segregation and stress31. Conversely, significantly downregulated genes (n = 619, log2(FC) < −1, adjusted P < 0.01) were enriched in the DNA replication, DNA repair and cell cycle pathways (Extended Data Fig. 4c), which is consistent with downregulation of DNA replication proteins in WGD cells7. Changes in expression were not associated with changes in compartment segregation and only moderately with boundary loss of insulation (Extended Data Fig. 4d,e), which indicated that these changes mostly reflected an acute cell response to WGD. In summary, WGD cells, but not CIN-only cells, exhibit LCS manifested in an increased proportion of contacts between long and short chromosomes, distinct chromatin subcompartments, and TADs./p> 0.4), which is a known oncogenic variant37. Nevertheless, this mutation was already present in RPE TP53−/− cells before WGD, and it was not sufficient to induce tumorigenesis in mice (Fig. 4c). Conversely, mutations that were acquired post-WGD did not include known oncogenic variants (Supplementary Table 3)./p> 0.3). These changes comprised upregulation of inducers of cell proliferation and migration such as CDC42, NRAS and JUN (chromosome 1p)42,43, and downregulation of CENPF (chromosome 1q), which is associated with mitotic errors44. NRAS copy number gain was accompanied by an increase in Q61R variant allele frequency (VAFtumour1 = 0.9, VAFtumour2 = 0.75, VAFtumour3 = 0.74), which suggested that the mutated allele was in the amplified haplotype. JUN overexpression was concomitant with an upregulation of components of the AP-1 transcription factor complex (JUND, JUNB, FOS and FOSB) and its downstream targets (Extended Data Fig. 8h). In summary, tumours originated from RPE TP53−/− cells that underwent WGD exhibited hallmarks of WGD-driven human tumours, such as increased CIN and complex rearrangements potentially associated with oncogene activation./p>

4N peak) were bulk sorted. Cells were allowed to recover overnight and then fixed for downstream analyses./p>

90%). Only Hi-C interactions for which anchors mapped strictly to one of the two haplotypes were retained for analysis, thus obtaining three sets of interaction types: Hap1–Hap1, Hap1–Hap2 and Hap2–Hap2./p>

2 for diploid loci) would indicate a nuclei aggregate rather than a single nucleus. Following dispensing, the single nuclei were de-crosslinked by incubation at 65 °C overnight. Next each selected nucleus was mixed with 25 µl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 and transferred to a 1.5 ml tube and incubated at room temperature for 1 h on a rotating wheel. The bead-bound fragments were digested with 10 U of AluI restriction enzyme (New England Biolabs, R0137) in 1× rCutSmart buffer (New England Biolabs, B6004) at 37 °C for 2 h. A-tailing reaction and adapter ligation were performed for each single cell as for the bulk Hi-C processing. Similarly, PCR amplification of the single cell libraries was performed in the same master mix as described above for bulk Hi-C, for 27–30 cycles. Libraries were cleaned using AMPure XP beads and then ran on a 2% agarose gel at 100 V for 50–60 min. Successful libraries presented a 300–700 bp smear, which was cut from the gel. DNA purification from the agarose was performed using NucleoSpin Gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel, 740609) following the manufacturer’s instructions. An additional AMPure XP bead size selection was generally necessary to remove any primer dimer contamination. Libraries were sequenced on a NextSeq550 platform (Illumina) in a PE75 configuration./p>

= 6, it was kept./p>

4N) (b) and c, Quantification of chromosomes per cell via karyotyping. Data are mean ± s.d.; Number of independent experiments is indicated. Violin plots: dashed line is median d, Examples of chromosomal instability markers (telomere fusion and chromosome breakages) in CP-ATP53−/− clone 19 cells 24 h post-WGD. n = 3 out of 30 total karyotypes presented such markers. Red arrows indicate affected chromosomes. e, Examples of bipolar and multipolar division in RPETP53−/− cells (Control and 24 h post-WGD). n = 5 dividing cells were detected for each phenotype out of ~100 total cells. Nuclei are stained in blue (DAPI), cytoskeleton (alpha-tubulin) in red, and centrosomes (pericentrin) in green./p>